（一）、前期做好充足的准备工作：

根据国家标准，提前准备好要用的平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液（生理盐水）、三角烧瓶等。

（二）、样品接受：

收到样品后，确认样品包装是否完好，并将其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力验证平台进行确认。

（三）、样品处理：

按照作业指导书操作（一定要仔细阅读作业指导书）看看是几个样品及实验记录要求。一般实验室收到的是干粉样品或者是固体样品等。假如收到的是干粉样品，那么第一步就要水化。

样品水化步骤（建议）：一般能力验证样品以国体粉末形式发放，以液体（CFU/mL）形式出报告。样品水化前一定要认真、仔细阅读作业指导书，看看用多少稀释液水化，水化后作为原液还是多大浓度的样品来记录。

（四）、实验前准备：

a、能力验证时最好在超洁净台或者生物安全柜里操作，这样就要把超洁净台或者生物安全柜提前清理、消毒处理，确保实验环境无菌。

b、提前把要用到的平皿、试管、稀释液等放到操作台上。

（五）、实验操作：

a、稀释

将样品从冰箱中取出达到室温后开启使用，在超洁净台或者生物安全柜下先用少许稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的稀释液进行洗涤并全部转入无菌瓶或袋中。（具体公需多少稀释液要看作业指导书说明）

洗涤转移时注意样品瓶盖的清洗和无菌操作，将全部的水化液进行均质混匀，一般作为原液立刻进行接种；再取25mL到225mL稀释液中均质混匀，制成10-1梯度样品匀液。

用1mL无菌吸管取1:10的样液到9mL生理盐水试管中，制成1:100的样液，以此类推。再将几个稀释度的样液接种到提前做好标记的无菌平皿中。

注意事项：

a.一般能力验证的样品添加的菌落浓度都比较高，检测过程一定要多做几个稀释度，每个稀释度多做几个平板平行。

b.梯度稀释：是关键步骤，必须尽可能地减少误差（新手建议涡旋混匀，涡旋时间不宜过长，长时间离心力等作用下，微生物细胞可能死亡）。

c、倾注用培养基应在48℃恒温装置内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无没有恒温装置保温，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

d、倾注培养基的量规定不一，从12~20mL不等，一般以15mL较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

e、倾注过程力度一定掌握好，绝不能把琼脂溅出来。

f、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿时要尽可能放在中央部位，然后应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

g、琼脂瓶放水浴锅前一定要混合均匀，以防出现平皿不凝固现象；拿出倾注时要用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。

h、冷却的过程不要着急，冷却充分后再倒置放进培养箱培养，放置的时候要尽量避免放到风机口处，每摞不要超过6个平皿。

i、检验结束后所有的稀释液样品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以备必须再用（一旦第二天发现实验做错了，在做一次实验，死马当活马医）。